甘薯轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展*

甘薯轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展^*
李志亮^1,2 吳忠義² 王玉文³ 邢浩春¹ 葉嘉¹ 張秀海² 黃叢林^2** 　
(¹邯鄲學(xué)院 生物科學(xué)系，河北 邯鄲 056005；²北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心, 北京 100097；³邯鄲市禾下土種業(yè)有限公司, 河北 邯鄲 056500)
摘 要：甘薯是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物, 同時也是新型的高能源作物。綜述了甘薯植株再生體系的建立及轉(zhuǎn)抗除草劑、抗逆、抗病毒、抗病、抗蟲、品質(zhì)改良等基因方面的研究進(jìn)展。此外，還對轉(zhuǎn)基因甘薯的發(fā)展前景作了簡要展望。
關(guān)鍵詞：甘薯 再生體系 遺傳轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)基因甘薯

Advancement of the Research on Transgenic Sweet Potato
(Ipomoea batatas Lam.) ^*
Li Zhiliang^{1, 2} Wu Zhongyi² Wang Yuwen³ Xing Haochun¹ Ye Jia¹ Zhang Xiuhai² Huang Conglin^2**
(¹Department of Biology Science, Handan College, Hebei Handan 056005; ²Beijing Research Center of Agro-Biotechnology, Beijing 100097; ³Handan Hexiatu Seeds Co. Ltd., Hebei Handan 056500)
Abstract: Sweet potato is an important food, forage and industrial crop. Its also a new high-energy source crop. The research on the establishment of genetic transformation systems of sweet potato is overviewed; meanwhile, the advancement of transgenic sweet potato, including enhancement of the herbicide, abiotic stress, virus, disease and insect resistance and improvement of nutrient quality is summarized in this paper. Furthermore, the perspective for development of transgenic sweet potato is forecasted.　
Key words: Sweet potato Regeneration systems Genetic transformation Transgenic sweet potato

甘薯(Ipomoea batatas Lam)，又名紅薯、白薯、紅芋、山芋、甜薯、地瓜、番薯、紅苕等，屬旋花科植物。原產(chǎn)于美洲中部和南美洲西北部的熱帶地區(qū)^[1,2]，現(xiàn)廣泛種植于世界100多個國家，是世界上重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物，同時也是新型的能源植物，具有產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、用途廣泛等特點。甘薯16 世紀(jì)末期傳入我國，在我國種植已有400多年的歷史，種植區(qū)域除高寒地區(qū)外，幾乎遍及全中國，主要分布于華南、華東和華北等地區(qū)，是世界更大的甘薯生產(chǎn)國^[1]。甘薯為無性繁殖作物，抗旱、耐瘠薄。甘薯穩(wěn)產(chǎn)性好，適應(yīng)不良?xì)夂驐l件能力較強(qiáng)，栽培容易^[3]。
甘薯營養(yǎng)豐富，含有多種保健功能成分，包括多糖、可溶性蛋白、膳食纖維、礦物質(zhì)、維生素和胡蘿卜素等初級產(chǎn)物^[1]，養(yǎng)分平衡，并且具有抗癌、抗氧化、抑制膽固醇生成、抗糖尿病、抗高血壓及增強(qiáng)免疫等多種保健功能^[2]。甘薯中的脫氫表雄酮能防止結(jié)腸癌和乳腺
^*基金項目：國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項資助項目(2009ZX08003-009B)；河北省教育廳自然科學(xué)研究項目（Z2006409）
第一作者簡介：李志亮（1966-）,男,河北魏縣人,博士,副教授。主要從事植物生理、植物細(xì)胞工程和分子生物學(xué)研究。E-mail:zhiliangli09@126.com
^**通訊作者: 黃叢林(1969-) ,男,四川仁壽縣人,博士,研究員,現(xiàn)從事植物抗旱、抗寒、耐鹽分子生物學(xué)及基因工程改良方向研究工作。E-mail:huangconglin@hotmail.com
癌發(fā)生，被譽(yù)為"抗癌之王"。甘薯中的咖啡酸衍生物，可以與艾滋病毒外層蛋白質(zhì)發(fā)生選
擇性化合作用，形成免疫細(xì)胞，使之阻礙HIV 感染，被認(rèn)為是抑制艾滋病發(fā)病的重要物質(zhì)^[4]。甘薯被世界衛(wèi)生組織 (WHO)評選為更佳食品之一，被營養(yǎng)學(xué)家推薦為合理的營養(yǎng)食品和理想的減肥食品^[1]。隨著世界人口的急劇增加和人類對營養(yǎng)要求的不斷提高，甘薯的研究、開發(fā)和利用越來越受到重視。
由于甘薯自交不親和性、雜交后代的不穩(wěn)定性及低結(jié)實性的特點，加上甘薯病毒病對甘薯減產(chǎn)的威脅，嚴(yán)重限制了甘薯育種中的資源利用。栽培種甘薯基本為六倍體，育種周期長，通過傳統(tǒng)育種很難進(jìn)行改良，不能滿足生產(chǎn)需要，因此，通過基因工程手段，即生物強(qiáng)化，進(jìn)行甘薯品種改良，培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)甘薯新品種，就具有極大的理論和實際意義^[5]?，F(xiàn)對甘薯植株再生體系的建立及轉(zhuǎn)抗除草劑、抗逆、抗病毒、抗病、抗蟲、品質(zhì)改良等基因方面的研究進(jìn)展作簡要綜述。此外，還對轉(zhuǎn)基因甘薯的發(fā)展前景作了簡要展望，期望能為轉(zhuǎn)基因甘薯的培育研究提供參考。
1 甘薯植株再生體系的建立
甘薯組織培養(yǎng)高頻率植株再生是進(jìn)行甘薯基因轉(zhuǎn)化重要的一步，而利用各種外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織是前提。由于甘薯存在的種間、種內(nèi)交配不親和性，嚴(yán)重限制了甘薯育種中的資源利用和親本選配。因此，利用組培技術(shù)培育再生植株是非常重要的。研究表明，甘薯植株的芽、莖段、莖尖、葉柄、葉片等均可作為愈傷組織誘導(dǎo)的外植體，在附加不同濃度的植物激素2,4-D、6-BA、KT、NAA或2,4,5-T，基本培養(yǎng)基則以MS為主。Mukherjee等（2001）研究發(fā)現(xiàn)，附加一定濃度的2,4-D和6-BA可以誘導(dǎo)甘薯產(chǎn)生胚性愈傷組織，添加5 g/L NaCl或 0.7g/L的脯氨酸和0.2 mg/L 2,4-D可顯著提高體細(xì)胞胚胎發(fā)生^[6]。周麗艷等（2002）研究認(rèn)為，1.0 mg/L 2,4-D與1.0 mg/L KT(或6-BA) 搭配有利于誘導(dǎo)高質(zhì)量的甘薯愈傷組織^[7]。張勇為等（2002）取甘薯芽和莖段接種至加有3%的蔗糖、2,4-D1mg/L、6-BA 0.1mg/L的MS培養(yǎng)基上，在黑暗下誘導(dǎo)愈傷組織^[8]。周麗艷等（2003）研究發(fā)現(xiàn)莖段愈傷組織分化能力好于葉柄、葉片；1.0～2.0mg/L 2,4-D與1.0mg/L KT組合有利于誘導(dǎo)胚性愈傷組織^[9]。王蘭蘭等（2006）用甘薯無菌苗植株上部的幼嫩葉片作為外植體在MS基本培養(yǎng)基，附加6-BA 0.5mg/L，NAA1.0mg/L的濃度配比誘導(dǎo)出愈傷組織^[10]。El Abidine Triqui等（2008）在附加2,4,5-T或毒莠定的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織，且胚性愈傷組織在轉(zhuǎn)入無激素培養(yǎng)基之前先在附加1mM 2,4-D和1 mM KT或者單獨加入5 mM ABA的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)可以大大植株提高再生率^[11]。何博文等（2009）研究表明，添加2mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)率高，誘導(dǎo)時間縮短，生長速度增快。同時，莖段比莖尖和葉片更易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織^[12]。周志林等（2010）研究表明，商薯19植株再生能力較強(qiáng)，更佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加NAA 0.1mg/L的MS培養(yǎng)基，其不同外植體植株再生能力由強(qiáng)到弱為莖段>葉片>葉柄^[13]。馬佩勇等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，添加2 mg/L 2,4-D和0.2mg/L 6-BA的MS固體培養(yǎng)基適合作為蘇薯9號胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，能明顯增加胚性細(xì)胞的誘導(dǎo)效率^[14]。蘇文瑾等（2012）以鄂薯6號為研究材料，結(jié)果表明，添加2.0 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)出愈傷組織所需的時間短，誘導(dǎo)率高，平均誘導(dǎo)率為95.6%^[15]。
2 甘薯的遺傳轉(zhuǎn)化
農(nóng)作物生產(chǎn)力受到它們內(nèi)在的生態(tài)生理特征與其生長的物理、化學(xué)和生物環(huán)境互作的影響。雜草、病蟲害和不利的氣候和土壤條件，如干旱、鹽堿等，是制約農(nóng)作物生產(chǎn)力的主要環(huán)境影響因素。所以，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法等遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行甘薯的基因工程改良培育抗逆性強(qiáng)、品質(zhì)好、產(chǎn)量高的甘薯新品種就顯得非常重要。
甘薯的遺傳轉(zhuǎn)化是指主要利用胚性愈傷組織、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體等作受體，通過某種技術(shù)和途徑轉(zhuǎn)入外源基因，獲得某些性狀、品質(zhì)改良的轉(zhuǎn)基因植株。迄今為止，在獲得的轉(zhuǎn)基因甘薯植株報道中，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法占絕大多數(shù)，其次是基因槍法等。目前，甘薯的轉(zhuǎn)基因研究取得了很大進(jìn)展，依據(jù)用于遺傳轉(zhuǎn)化的功能基因的不同，涉及抗除草劑、抗逆、抗病毒、抗病、抗蟲、品質(zhì)改良等方面。
2.1 抗除草劑基因
PPT乙?；D(zhuǎn)移酶（bar）基因的表達(dá)可使植物具有一定的除草劑抗性，因而被廣泛應(yīng)用于抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物的生產(chǎn)。Otani等（2003）利用攜帶有bar基因的根癌農(nóng)桿菌EHA101轉(zhuǎn)化甘薯胚性愈傷組織獲得除草劑biolaphos抗性的轉(zhuǎn)基因植株^[16]。Yi等（2007）利用基因槍法將bar基因轉(zhuǎn)入甘薯胚性愈傷組織，獲得除草劑Basta抗性的轉(zhuǎn)基因植株^[17]。Choi等（2007）用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將bar基因轉(zhuǎn)入甘薯胚性愈傷組織，獲得除草劑Basta抗性的轉(zhuǎn)基因植株^[18]。臧寧等（2007）用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將bar 基因?qū)敫适碇髟云贩N徐薯18 的胚性懸浮細(xì)胞中，獲得了抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植株^[19]。臧寧等（2008）以甘薯品種栗子香的胚性懸浮細(xì)胞為受體材料，獲得了表達(dá)bar基因的抗除草劑轉(zhuǎn)基因甘薯植株^[20]。阮龍等（2010）用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了表達(dá)抗除草劑抗性基因bar基因的甘薯植株^[21]。
2.2 抗逆基因
目前，已獲得抗鹽、干旱、寒及熱等逆境的轉(zhuǎn)基因甘薯植株。Kasukabe等（2006）利用根癌農(nóng)桿菌EHA101將黑籽南瓜的亞精胺合成酶基因（FSPD1）轉(zhuǎn)入甘薯中，與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株對諸如鹽、干旱、寒及熱等環(huán)境脅迫表現(xiàn)出高耐性^[22]。Fan等（2012）通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)菠菜甜菜堿醛脫氫酶SoBADH基因甘薯植株。轉(zhuǎn)基因植株對包括鹽、氧化脅迫和低溫等各種非生物脅迫的耐性增強(qiáng)^[23]。李建梅等（2007）的結(jié)果表明，在脅迫及復(fù)水條件下轉(zhuǎn)Cu/Zn-SOD和APX基因甘薯的抗氧化系統(tǒng)可以更好地保護(hù)及修復(fù)光合機(jī)制^[24]。Park等（2011）過表達(dá)IbLEA14的轉(zhuǎn)基因甘薯愈傷組織對鹽和干旱脅迫的耐性增強(qiáng)^[25]。王欣等（2011）的研究表明，轉(zhuǎn)入Cu/Zn SOD和APX基因增強(qiáng)了脅迫下甘薯清除活性氧的能力，從而提高了甘薯的耐鹽性^[26]。Kim等（2012）利用RNA干擾技術(shù)沉默CHY-β基因。在轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)細(xì)胞中，ABA含量增加，對鹽脅迫耐性增強(qiáng)^[27]。阮龍等（2010）利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了轉(zhuǎn)干旱耐逆基因HS1的基因甘薯植株^[21]。成雨潔等（2012）的研究表明Cu/Zn-SOD和APX基因可以顯著增加干旱脅迫下甘薯塊根膨大期的SOD、APX 活性和可溶性糖含量，提高其水分利用效率，從而減輕干旱脅迫對產(chǎn)量的影響^[28]。Kim等（2011）獲得轉(zhuǎn)大豆冷誘導(dǎo)鋅指蛋白SCOF-1基因的甘薯植株，與對照相比，轉(zhuǎn)基因植株對低溫脅迫耐性增強(qiáng)^[29]。
2.3 抗病毒基因
甘薯病毒嚴(yán)重影響產(chǎn)量?？垢适硗示G矮化病毒（SPCSV；毛形病毒屬，長線形病毒科）是甘薯更重要的病原之一，可導(dǎo)致減產(chǎn)50%，當(dāng)和包括甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV；馬鈴薯 Y 病毒屬，馬鈴薯Y病毒科)在內(nèi)的其它病毒共侵染時，可產(chǎn)生各種協(xié)同疾病復(fù)合體。Kreuze等（2008）研究利用靶向編碼SPCSV和SPFMV序列復(fù)制酶的內(nèi)含子剪接的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi策略通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化甘薯，轉(zhuǎn)基因植株對SPCSV和SPFMV的抗性顯著增強(qiáng)^[30]。
2.4 抗病基因
由病原真菌甘薯黑斑病菌（Ceratocystis fimbriata）引起的甘薯黑斑病嚴(yán)重影響植株生長和收獲后的貯藏。植物硫素（thionin）是一類富含半胱氨酸的植物抗病蛋白，可以抗甘薯黑斑病菌。Muramoto等（2012）的研究表明，轉(zhuǎn)大麥αHT（α-hordothionin）基因的甘薯植株的葉片和塊根表現(xiàn)出對黑斑病菌的抗性，可以減少黑斑病對甘薯造成的損失以及農(nóng)藥的使用^[31]。
2.5 抗蟲基因
研究發(fā)現(xiàn)，水稻巰基蛋白酶抑制劑基因（OCI）對M.incognita， G.pallida， H.glycines等多種植物線蟲具有明顯的抗性，而甘薯莖線蟲病是甘薯更嚴(yán)重的病害之一。蔣盛軍等（2004）用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將水稻巰基蛋白酶抑制劑基因（OCI）導(dǎo)入甘薯品種栗子香獲得了轉(zhuǎn)基因植株，對轉(zhuǎn)基因甘薯植株對甘薯線蟲病的抗性進(jìn)行了初步研究^[32]。
2.6 品質(zhì)改良基因
2.6.1 基于淀粉的品質(zhì)改良基因
甘薯IbSBEII基因編碼的淀粉分支酶,是淀粉體內(nèi)合成支鏈淀粉的關(guān)鍵酶。Shimada等（2006）構(gòu)建了dsRNA干擾載體并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化進(jìn)入甘薯基因組。與對照相比，轉(zhuǎn)IbSBEII基因植株的淀粉具有較高的直鏈淀粉含量^[33]。Otani等（2007）通過RNA干擾技術(shù)抑制甘薯淀粉粒附著性淀粉合成酶I（GBSSI）基因的表達(dá)培育出不含直鏈淀粉的轉(zhuǎn)基因甘薯植株^[34]。Takahata等（2010）通過抑制淀粉合成酶Ⅱ（SSⅡ）的表達(dá)改變支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)降低甘薯淀粉的糊化溫度，轉(zhuǎn)基因植株比對照植株降低10-15℃^[35]。
甘薯塊根中含有大量的淀粉，在乙醇產(chǎn)量上和玉米相當(dāng)甚至超過玉米。乙醇生產(chǎn)需要高溫和能耐熱性和傳熱的淀粉水解酶的作用將淀粉轉(zhuǎn)變成可發(fā)酵糖，而這些酶需加到淀粉混合物中從而加大整體過程經(jīng)濟(jì)投入。為克服這一缺陷，Santa-Maria等（2011）從海棲熱袍菌（Thermotoga maritima）中克隆了一個編碼極端嗜熱α-淀粉酶的基因，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植株具有自發(fā)處理淀粉的能力。在40℃以下該酶活性不顯著，但在80℃時，轉(zhuǎn)基因甘薯植株塊根中的淀粉很容易被水解，具有極端嗜熱糖苷水解酶的工程植物能夠促進(jìn)淀粉轉(zhuǎn)變成可發(fā)酵糖的投入成本更加有效^[36]。
2.6.2 基于蛋白質(zhì)的品質(zhì)改良基因
乳鐵蛋白也稱乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，是乳汁中主要的鐵結(jié)合蛋白，廣泛分布于多種組織細(xì)胞內(nèi)，具有非特異性免疫、參與鐵代謝和細(xì)胞生長調(diào)節(jié)等功能。與其它動物乳鐵蛋白相比，人乳鐵蛋白更適于人類食用^[37]。羅紅蓉等（2002）用攜帶有含人乳鐵蛋白基因(hLFc)的根癌農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化甘薯高頻獲得抗性愈傷組織，為獲得具有轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因的甘薯材料奠定了基礎(chǔ)^[38]。
玉米醇溶蛋白是玉米中主要的貯藏蛋白，可用于甘薯蛋白質(zhì)品質(zhì)改良。高峰等（2001）獲得轉(zhuǎn)玉米醇溶蛋白的轉(zhuǎn)基因甘薯植株^[39]。畢瑞明等（2007）檢測轉(zhuǎn)10kD玉米醇溶蛋白基因甘薯蛋白質(zhì)及農(nóng)藝性狀的變化，初步證明外源目的基因在轉(zhuǎn)基因甘薯中能夠表達(dá)^[40]。 　
2.6.3 基于保健功能的品質(zhì)改良基因
脂聯(lián)素(Adiponectin)是由脂肪細(xì)胞分泌的一種30kDa特異性蛋白，作為一種細(xì)胞因子，與肥胖癥、胰島素抗性及2型糖尿病有關(guān)，具有抗炎、增加機(jī)體對胰島素敏感性和降糖、抗動脈粥樣硬化的作用。Berberich等（2005）利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化獲得表達(dá)Adiponectin cDNA的轉(zhuǎn)基因甘薯植株^[41]。β-胡蘿卜素羥化酶(CHY-β)是類胡蘿卜素β-β-分支生物合成中的關(guān)鍵調(diào)控酶，它可以使β-胡蘿卜素羥基化為β-玉米黃質(zhì)，β-玉米黃質(zhì)羥基化為玉米黃質(zhì)。為增加甘薯中的β-胡蘿卜素的含量，Kim等（2012）利用RNA干擾技術(shù)沉默CHY-β基因。在轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)細(xì)胞中，類胡蘿卜素含量高達(dá)117μg/g干重，β-胡蘿卜素達(dá)34.43μg/g干重^[27]。
2.7 其他基因
為闡明甘薯貯藏根形成機(jī)制。Noh等（2013）利用反義IbEXP1基因甘薯植株為材料研究了甘薯擴(kuò)張基因IbEXP1在甘薯貯藏根形成中的作用，結(jié)果表明，IbEXP1基因在貯藏根形成中起負(fù)向作用，通過阻抑后生木質(zhì)部和形成層細(xì)胞的增殖來抑制貯藏根的加厚生長 ^[42]。
3 展望
甘薯屬于雙子葉植物，它本身是農(nóng)桿菌的天然寄主，因此，可以利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行甘薯的基因工程改良。研究實踐也證明，基因槍法也是甘薯有效地遺傳轉(zhuǎn)化方法。目前，甘薯的轉(zhuǎn)基因研究在抗除草劑、抗逆、抗病毒、抗病、抗蟲、品質(zhì)改良等方面取得了一定的進(jìn)展，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對品種改良的要求。
雜草對甘薯的危害性很大，雜草與甘薯爭奪水分、養(yǎng)分和陽光，導(dǎo)致莖葉生長緩慢，塊根發(fā)育不良，嚴(yán)重減產(chǎn)，因此，向甘薯體內(nèi)導(dǎo)入抗草丁膦的bar基因，培育抗除草劑的轉(zhuǎn)基因甘薯，進(jìn)而減輕田間管理的工作量，降低管理成本，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和應(yīng)用前景。
病毒病是甘薯的主要病害之一，據(jù)國際馬鈴薯中心（International Potato Center，CIP）報道，甘薯因病毒侵染造成的減產(chǎn)高達(dá)50%以上。目前，解決這一問題的主要途徑是培育甘薯脫毒苗，恢復(fù)甘薯優(yōu)良種性，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，但脫毒甘薯也存在病毒再感染的問題。而另一條根本途徑就是培育抗病毒品種。研究表明，抗病毒蛋白(AVP)在多種植物中存在，并且對多種病毒具有抗性。如美洲商陸抗病毒蛋白（Pokeweed antiviral protein， PAP）屬于廣譜性抗植物病毒蛋白，對多種RNA、DNA 病毒具有抗性^[43]。因此，分離植物抗病毒蛋白，培育抗病毒轉(zhuǎn)基因甘薯具有重要的實踐價值和經(jīng)濟(jì)前景。
由于甘薯主要通過無性繁殖進(jìn)行田間種植，不會因大量傳粉引起基因漂移，因此，對甘薯進(jìn)行基因工程改良的環(huán)境安全風(fēng)險性較小?？梢灶A(yù)言，隨著分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、植物基因工程等相關(guān)學(xué)科的迅速發(fā)展，甘薯轉(zhuǎn)基因的研究將會取得更進(jìn)一步的進(jìn)展。

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